Efficacité de la ceftazidime dans un modèle murin suite à une exposition létale à un aérosol de Burkholderia pseudomallei

Étudier le design

Les souris femelles placées dans l’étude étaient âgées d’au moins 6 semaines au moment de l’arrivée, pesaient entre 16 et 20,1 g le jour de l’exposition et étaient exemptes de signes cliniques de maladie au moment de l’exposition. Les souris ont été randomisées dans des groupes d’étude en fonction du poids corporel. L’attribution à motifs a été utilisée pour sélectionner les animaux des groupes 1, 11, 12 et 13 en sous-groupes et pour sélectionner tous les animaux de l’étude selon un ordre d’épreuve. Au moins un animal de chaque groupe d’étude a été sélectionné pour chaque test d’exposition. Cent quatre-vingt-dix souris BALB/c femelles ont été exposées à B. pseudomallei (souche K96243) à un objectif de 8100 ufc/animal, équivalent à 50 × LD₅₀ (dose inhalée moyenne réelle de 11 100 ufc ; 69 × LD₅₀) sur une seule journée. Dix cycles d’exposition aux aérosols de 19 souris par cycle ont été effectués. Les concentrations d’aérosols de tous les cycles d’exposition variaient de 7 450 UFC/animal à 18 300 UFC/animal (écart-type de 4 119 UFC/animal). Le diamètre aérodynamique médian en masse des particules inhalées variait de 1,26 à 1,31 µm (écart type géométrique de 1,47 à 1,56 µm), permettant un dépôt pulmonaire inférieur des particules inhalées^33,34. Après exposition aux aérosols, les souris ont été traitées avec un article test (ceftazidime) ou un article témoin (solution saline stérile). Deux cohortes de traitement ont été incluses dans l’étude. La première cohorte a examiné l’efficacité d’un régime de ceftazidime de 14 jours en évaluant la charge bactérienne dans les tissus et la survie 60 jours après l’arrêt du traitement. Huit schémas thérapeutiques distincts ont été évalués (tableau 1) qui comprenaient deux fréquences de traitement : deux fois par jour (BID) et quatre fois par jour (QID) ; deux points de temps d’initiation : 24 h post-exposition (24 h) et 48 h post-exposition (48 h) ; et deux dosages : 600 mg/kg/jour et 1200 mg/kg/jour. La dose de 600 mg/kg/jour a été obtenue en administrant 300 mg/kg BID ou 150 mg/kg QID tandis que la dose de 1200 mg/kg/jour a été obtenue en administrant 600 mg/kg BID ou 300 mg/kg QID. Les doses ont été administrées environ toutes les 12 h pour le dosage BID et environ toutes les 6 h pour le dosage QID. La charge tissulaire a été examinée dans les reins, le foie, les poumons et la rate chez toutes les souris traitées, ainsi que dans une cohorte de souris non traitées à 24, 36, 48 et 60 h après l’exposition pour évaluer la progression de la maladie. Une cohorte satellite de souris a été utilisée pour l’analyse pharmacocinétique de trois doses de ceftazidime après une dose unique administrée environ 24 h après l’exposition. Aucun animal exposé n’a été exclu de l’analyse de survie. Aucun aveuglement ou masquage n’a été utilisé pendant la conduite de l’étude.

Système d’essai

Des souris BALB/c femelles, âgées de six à huit semaines à l’arrivée, ont été achetées auprès de Charles River Laboratories (Stone Ridge, NY). Les procédures générales pour les soins et l’hébergement des animaux sont conformes aux recommandations internationales de l’AAALAC, aux exigences actuelles énoncées dans le « Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire » (National Research Council, édition actuelle), aux exigences actuelles telles qu’énoncées par le ministère de l’Agriculture des États-Unis par le biais de l’Animal Welfare Act, telle que modifiée, et conforme aux procédures d’exploitation standard de l’installation de test. Le protocole d’utilisation des animaux a été approuvé par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) et par le Bureau d’examen des soins et de l’utilisation des animaux de l’armée américaine (ACURO). Les résultats de l’étude ont été rapportés conformément aux directives ARRIVE.

Articles de test et de contrôle

La ceftazidime pour injection, USP (Hospira, Lake Forest, IL) a été diluée à 95 mg/mL dans de l’eau stérile pour injection, USP. Les solutions de dosage ont ensuite été diluées dans une solution saline stérile, USP à 15, 30 ou 60 mg/mL pour obtenir des dosages de 150 mg/kg/dose, 300 mg/kg/dose et 600 mg/kg/dose, respectivement. Une solution saline stérile a été administrée aux animaux du groupe témoin. Les doses ont été administrées par voie intrapéritonéale (IP) à un volume cible de 10 mL/kg. Les injections ont été administrées au niveau des sites controlatéraux à chaque administration pour minimiser les lésions tissulaires localisées.

Agent de provocation et exposition aux aérosols

Burkholderia pseudomallei la souche K92643 a été utilisée pour les expositions animales. La sélection des souches était basée sur la caractérisation interne précédente. Les tests de concentration minimale inhibitrice (CMI) menés en interne de la souche K96243 ont donné une CMI de 1 µg/mL pour la ceftazidime. Le lot utilisé pour les expositions aux aérosols a été propagé et caractérisé par le Centre de Recherche Biomédicale Battelle. Frais B. pseudomallei les suspensions ont été préparées en inoculant le matériel de base avec du bouillon LB avec 4% de glycérol (LBG) et en incubant à 37 ° C (± 2 ° C) et en agitant à 250 tr / min pendant 18 à 24 h. La culture de départ résultante a été diluée dans du LBG stérile pour atteindre une DO₆₀₀ de 0,200 (± 0,05). Cette culture a ensuite été incubée à 37 °C (± 2 °C) et 250 tr/min pendant 18 à 20 h. La pureté de la culture a été examinée après coloration de Gram. La culture a ensuite été centrifugée à 10 000 rcf pendant dix minutes. Le culot résultant a été lavé et remis en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate avec de la gélatine et du tréhalose (BSGT). La procédure de lavage et de remise en suspension a été répétée deux fois au total. La suspension a été retirée et ajustée avec un tampon pour atteindre une DO₆₀₀ de 2,1 (± 0,1). Les expositions aux aérosols ont été menées comme décrit précédemment³⁵. Une dose inhalée de 8100 ufc équivaut à 50 × LD₅₀a été ciblé par souci de cohérence avec les précédentes expériences de développement de modèles internes.

Prélèvement de sang total et analyse pharmacocinétique

La collecte de sang cardiaque a été effectuée comme une procédure terminale. Avant la collecte, les souris ont été anesthésiées avec un mélange de kétamine (80 à 100 mg/kg) et de xylazine (5 à 10 mg/kg). Des échantillons de bactériémie ont été prélevés dans K₃Tubes EDTA et maintenus à température ambiante jusqu’au traitement. Des échantillons pharmacocinétiques (PK) ont été prélevés dans K₃Tubes EDTA et stockés sur de la glace humide jusqu’au traitement. Le plasma a été récolté et filtré stérilement à l’aide d’un filtre PES de 0,2 micron. Les échantillons ont été stockés dans un congélateur réglé pour maintenir – 80 ° C jusqu’à l’analyse.

La ceftazidime a été extraite du plasma et quantifiée à l’aide d’une méthode de chromatographie liquide à haute performance et de spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) développée en interne. Il s’agit d’une méthode sensible et à haut débit utilisant l’extraction par précipitation des protéines suivie d’un échange de cations forts (SCX) LC-MS/MS. La détection a été réalisée à l’aide d’un HPLC Shimadzu Prominence XR Series et d’un spectromètre de masse AB Sciex Triple Quad 5500 en mode d’ionisation positive (ESI⁺). La séparation chromatographique a été obtenue à l’aide d’une colonne Agilent Zorbax 300-SCX 5µ, 2,1 × 150 mm, une phase mobile à gradient constituée de 95:5 formiate d’ammonium 25 mM:acétonitrile (v:v) (A) et 70:30 formiate d’ammonium 25 mM :acétonitrile avec addition de formiate d’ammonium 500 mM (B) à un débit de 0,5 mL/min., et une température du four à colonne de 30 °C. Le pentahydrate de ceftazidime obtenu auprès de la US Pharmacopeia (USP) a été utilisé dans la préparation des solutions pour les étalons et les échantillons de contrôle de qualité préparés dans le plasma de souris. Un analogue chimique, le chlorhydrate de céfépime obtenu auprès de l’USP, a été préparé comme étalon interne. L’ajout de l’étalon interne a permis une quantification reproductible car la ceftazidime et la céfépime ont été contrôlées à l’aide de la surveillance de réactions multiples (MRM) à 547,0/468,0 et 481,0/86,0 respectivement. L’analyse de régression a été évaluée en analysant un ensemble d’étalons d’étalonnage à huit concentrations. La limite inférieure de quantification de la ceftazidime a été déterminée à 50 ng/mL dans le plasma en utilisant un échantillon de 100 µL.

Les concentrations plasmatiques libres ont été ajustées en utilisant une liaison aux protéines estimée à 26 % et 15 % pour les souris et les humains, respectivement³⁶. La pharmacocinétique et les paramètres d’exposition ont été estimés à l’aide d’une analyse non compartimentale avec le logiciel Phoenix WinNonlin (Certara LP, Princeton, NJ). Les critères d’acceptation suivants ont été utilisés pour évaluer les profils concentration-temps : (1) le coefficient de détermination (r²) pour la phase linéaire terminale était supérieure ou égale à 0,85, (2) l’heure de la dernière concentration observée était supérieure à trois fois la demi-vie, et (3) l’ASC_∞ avait moins de 20 pour cent de la superficie extrapolée. Les données de la souris ont ensuite été ajustées à un modèle compartimental dans WinNonlin qui a été utilisé pour simuler les concentrations pour atteindre la cible PK/PD.

Collecte de tissus et dénombrement bactérien

Au moment de l’autopsie, une partie des reins, du foie, des poumons et de la rate ont été prélevés aseptiquement sur chaque souris, pesés et homogénéisés individuellement dans 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco avec 0,01 % de gélatine (BSG) à l’aide d’un dissociateur gentleMACS ( Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne). Les homogénats de tissus ont été dilués en série en trois exemplaires et étalés sur de la gélose LB avec 4 % de glycérol (LBGA) ou de la gélose au sang Columbia. Les plaques d’étalement ont été placées dans un incubateur réglé pour maintenir 37 ° C pendant une moyenne de 58 h (41, 4 à 93, 1 h). Les plaques ont été dénombrées et les ufc/gramme de tissu calculés pour l’analyse statistique.

analyses statistiques

Les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide de SAS (version 9.4) et R (version 3.6.3) sur la plate-forme 64 bits. Pour la détermination de la taille des groupes, une analyse de puissance basée sur un test de Boschloo unilatéral réalisé à un taux d’erreur de type I de 5 % a été réalisée pour détecter des différences statistiquement significatives dans les taux de survie entre un seul groupe traité et un groupe témoin. En supposant qu’un groupe témoin a un taux de survie de 5 %, dix animaux par groupe de traitement permettent une puissance de 88 % en supposant que la probabilité de survie dans le groupe traité est d’au moins 60 %. Deux animaux supplémentaires inclus dans les groupes post-exposition 48 h ont permis de maintenir la significativité statistique en cas de décès précoces. La proportion d’animaux survivants et l’intervalle de confiance exact à 95 % ont été calculés pour chaque groupe de la cohorte d’efficacité. Des tests unilatéraux de Boschloo ont été utilisés pour comparer les proportions de survie entre chacun des groupes traités et le groupe témoin salin (groupe 2) à la fin de l’étude, à la fin du traitement et 30 jours après l’arrêt du traitement. Les tests bilatéraux de Boschloo ont été utilisés pour comparer les proportions de survie entre chaque paire de points dans le temps au sein de chaque groupe. La procédure de comparaison multiple de Bonferroni-Holm a été utilisée pour contrôler le taux d’erreur global de type I pour chaque série de tests à 5 %. Le test du log-rank a été utilisé pour tester les différences significatives de temps jusqu’au décès entre chacun des groupes traités et le groupe témoin salin. La procédure de comparaison multiple de Bonferroni-Holm a été utilisée pour contrôler le taux d’erreur global de type I dans tous les tests à 5 %. Des courbes de Kaplan-Meier ont été tracées pour chaque groupe afin de représenter visuellement les données de survie et de délai avant la mort. Pour l’évaluation quantitative des charges bactériennes dans les tissus, des moyennes géométriques et des intervalles de confiance à 95 % ont été calculés pour chaque type de tissu par groupe. Des modèles d’analyse de variance (ANOVA) ont été ajustés aux charges bactériennes transformées en logarithme de base 10 pour évaluer les effets du traitement sur les charges bactériennes tissulaires. La charge bactérienne moyenne pour chacun des groupes de traitement a été statistiquement comparée à celle du groupe témoin salin (groupe 2) dans le modèle pour chaque type de tissu. La procédure de comparaison multiple de Dunnett a été utilisée pour contrôler le taux d’erreur global de type I sur tous les tests par tissu à 5 %.